免疫荧光技术_荧光免疫层析_免疫荧光定量分析

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免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。

青岛菲优特检测有限公司以科学研究为首任,以客户为中心,在严格的程序下开展检测工作,为客户提供专业科学的检验检测、研发分析服务。

实验流程

免疫荧光单标记方法

免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子,方法比较简单,只要按照染色步骤去做,通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择,固定液选择的合适与否,可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。

1、所需材料与试剂

a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。

b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。

d. 封闭液。

e. 0.01mol/LPBS缓冲液。

2、染色方法

a.取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿,用0.01MPBS洗2-3遍。

b.加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d.正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min,抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。

e. 去掉正常血清,直接加入一抗,37℃孵育1 h或4℃过夜。抗体以0.01 mo/LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。

f. 0.3% TritonX-100洗5 min,0.01 mol/IPBS洗5 min,0.3% TritonX 5 min,0.01 M PBS洗5 rain。

g. 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,37℃,孵育1h。

h. 0.3%TritonX-100洗5rain,0.01 mol/LPBS洗5min,0.3% Triton X 5min,0.01mol/LPBS洗5 min,用滤纸吸干。

i. 90%甘油(PBS配制)封片。

j. 激光扫描共焦显微镜下观察,或于4℃避光保存。

免疫荧光双标记方法

免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子,当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些,首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如:A抗体为多克隆抗体,来自家兔;B抗体为单克隆抗体,来自小鼠)。

其次,两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠,且尽量远离,通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下,染色时两种一抗可以同时孵育,然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱,而另一种颜色比较强时,应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。

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